Để quan sát được tế bào vi khuẩn, người ta sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: Tiêu bản soi tươi, tiêu bản nhuộm.
1. Phương pháp làm tiêu bản soi tươi (giọt ép, giọt treo)
Tiêu bản giọt ép: Dùng phiến kính sạch đã tẩy mỡ, giỏ lên phiến kính một giọt canh
khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, sau đó đậy lamelle (lá kính) lên, quan sát kính
hiển vi quang học.
Tiêu bản giọt treo: dùng phiến kính có hốc lõm ở giữa, cho lên giữa la men một giọt
canh khuẩn hay dung dịch bệnh phẩm, đậy phiến kính lên, sau đó lật ngược phiến
kính sao cho giọt dung dịch treo lơ lửng trong hốc lõm, cho vaselin lên cạnh
của la men để chống mất nước.
Sau khi làm tiêu bản soi tươi, quan sát kính
hiển vi quang học có thể biết được hình thái, kích thước, tính chất di động của
vi khuẩn, nó cho phép bước đầu phân biệt, nhận dạng được hình thái của vi
khuẩn.
2. Phương pháp làm tiêu bản nhuộm và soi kính hiển vi quang học
Khi quan sát mẫu vật qua kính hiển vi quang
học, phần lớn cơ cấu bên trong của vi sinh vật có chiết suất gần bằng nhau cho
nên rất khó phân biệt được. Để có thể quan sát dễ dàng hơn chúng ta phải nhuộm
màu tiêu bản.
Nhuộm vi khuẩn quan sát dưới kính hiển vi
quang học là phương pháp không thể thiếu được trong quá trình xét nghiệm vi
khuẩn.
Phần lớn màu nhuộm trong vi sinh vật là các
muối và được phân làm hai nhóm: nhóm màu acid gồm các muối mà ion mang màu là
anion (mang điện tích -), và các nhóm base có ion mang màu là các cation (mang
điện tích dương). Ví dụ: sodium+ (có tính base), eosinate-(có
tính acid).
Màu acid vì nó mang màu hợp với một base
(NaOH) để cho ra muối màu. Còn màu base vì ion mang màu có tác dụng như một
base, phối hợp với một acid (HCl) cho ra muối màu.
Một cách tổng quát, màu acid phối hợp chặt với
thành phần của tế bào chất của tế bào còn màu base phối hợp (ăn màu) với thành
phần của nhân tế bào (có tính acid).
Một số màu thuốc nhuộm chỉ bao phủ mặt ngoài
mẫu vật, được nhuộm do quá trình hấp thu hoặc nó tan hay kết tủa chung quanh
vật được nhuộm.
Nhuộm đơn: là phương pháp nhuộm màu chỉ sử
dụng một loại thuốc nhuộm, các loại thuốc nhuộm thường dùng là methylene blue,
crystal violet, fuchsin, với nấm thường dùng dung dịch Lactophenol cotton blue
(nấm bắt màu xanh).
Nhuộm Gram: phương pháp này do Hans Christian
J. Gram (1853-1938) là phương pháp nhuộm màu kép phổ biến trong nghiên cứu vi
khuẩn, thường dùng để nhuộm màu của một số chi vi khuẩn, cũng có những chi
không bắt màu. Phương pháp nhuộm màu này cho phép chúng ta chia vi khuẩn ra làm
hai nhóm chính, nhóm vi khuẩn Gram âm và nhóm vi khuẩn Gram dương, đây là
phương pháp quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn.
Phương pháp nhuộm Gram
Đầu tiên cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn
cồn, nhuộm màu qua 4 bước:
-
Thuốc đầu tiên là dung dịch tím tinh thể (Crystal
violet) trong khoảng 1 phút. Rửa bằng nước.
-
Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol (dung dịch cồn Iot 1%)
trong 1phút, rửa lại bằng nước.
-
Phủ lên vết bôi dung dịch tẩy màu (metanol 95% aceton
1:1) hoặc cồn 960 trong khoảng 20 giây đến 1 phút, rửa bằng nước,
-
Cuối cùng nhỏ lên vết bôi dung dịch fuchsin (đỏ tía)
hay safranin (đỏ vàng) để 1 phút rửa nước, để khô tự nhiên sau đó soi dưới kính
hiển vi.
Nhóm vi khuẩn Gram dương có đặc tính không bị
dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím tinh thể và Iod. Kết quả cuối cùng
sẽ bắt màu tím. Nhóm vi khuẩn Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa
tím tinh thể và Iod, do đó sẽ bắt màu thuốc nhuộm bổ sung, kết quả bắt màu đỏ
hồng.
Bằng nhiều phương pháp kỹ thuật nhuộm khác
nhau như phương pháp nhuộm đơn, nhuộm kép.
Nhuộm tiên mao: Đường kính của roi vi khuẩn rất nhỏ nên khó
quan sát được ở kính hiển vi quang học. Để quan sát được cần nhuộm màu đặc
biệt. Nguyên tắc, trước hết phủ lên roi một lớp hóa chất để làm cho roi to ra,
hóa chất này giữ màu nhuộm. Hóa chất thường dùng để phủ lên roi có thể là
tannic acid, màu nhuộm có thể dùng pararosanniline.
